Pas les suspects habituels : 5 lacunes dans votre programme de surveillance de l'environnement

Même les programmes de surveillance du nettoyage et de la désinfection les mieux planifiés comportent des zones d'ombre. Stefan Widmann examine de plus près cinq des lacunes les plus probables - et les plus dangereuses - de votre programme de surveillance environnementale et explique ce qu'elles sont, pourquoi vous devriez vous en préoccuper et ce que vous pouvez faire pour y remédier.

#1 Micro-organismes viables mais non cultivables (VBNC)

Pendant longtemps, les microbiologistes ont supposé que toute bactérie qui ne se développait pas sur un milieu de culture normal était morte. Des recherches ultérieures ont révélé qu'il existe un troisième état, au-delà de l'état viable et de l'état mort : l'état viable mais non cultivable (VBNC).

En général, les bactéries à l'état VBNC ne se multiplient pas mais sont toujours vivantes, comme le montre leur activité métabolique. Ce qui nous intéresse le plus, c'est le fait qu'elles peuvent devenir cultivables après réanimation et donc proliférer dans les aliments. En outre, certaines bactéries pathogènes ne se développent pas en l'absence d'hôte et n'ont besoin que de survivre dans les aliments jusqu'à l'ingestion pour provoquer une maladie.

Il existe de nombreuses raisons pour lesquelles les bactéries peuvent passer à l'état de VBNC ; la famine, l'incubation en dehors de la plage de température optimale pour la croissance, des concentrations osmotiques élevées, des niveaux de concentration d'oxygène ou l'exposition à la lumière blanche n'en sont que quelques-unes. Les caractéristiques spécifiques de la souche bactérienne en question déterminent ce qui fait que les bactéries entrent dans cet état.

Pourquoi faut-il s'en préoccuper ? Certaines bactéries capables d'entrer dans l'état VBNC sont préoccupantes pour la fabrication des denrées alimentaires. Si nous ne connaissons pas encore toutes les espèces bactériennes qui peuvent devenir VBNC, nous en connaissons certaines qui y parviennent ; elles comptent parmi elles des organismes indicateurs (tels que Klebsiella aerogenes et Klebsiella pneumoniae), des adultérants (tels que Lactobacillus plantarum et Lactococcus lactis) et des agents pathogènes (tels que Salmonella Typhimurium, Campylobacter coli ou Listeria monocytogenes).

Après les avoir identifiées, nous devons maintenant nous demander si ces bactéries peuvent revenir à un état pleinement cultivable et potentiellement pathogène. Pendant longtemps, les microbiologistes sont restés dans l'ignorance de cette question, car il est difficile de séparer complètement les bactéries VBNC des bactéries cultivables. Les chercheurs ont résolu ce problème, en partie, en utilisant une approche statistique : ils diluent un grand nombre de bactéries VBNC jusqu'à ce qu'il soit presque impossible de conserver des bactéries cultivables. Les bactéries sont ensuite comptées après une période de temps définie. Si une forte croissance est observée, la seule conclusion possible est que les bactéries ont quitté l'état de VBNC et sont devenues cultivables.

Un autre corollaire est que si elles peuvent revenir à un état cultivable, elles peuvent aussi redevenir pathogènes. Il existe des exemples où ce phénomène a conduit à des épidémies. Par exemple, les E. coli O157 VBNC ont été suspectés dans une épidémie au Japon en 1997, étant donné que le nombre total d'E. coli était insignifiant et que les souches shigatoxigènes telles que O157 pouvaient provoquer des maladies en très petit nombre.

#2 Bactéries anaérobies et microaérophiles

Les bactéries anaérobies ou, plus généralement, les micro-organismes anaérobies, peuvent être divisés en trois groupes : obligatoires, aérotolérants et facultatifs. Comme leur nom l'indique, ils ont chacun des exigences particulières vis-à-vis de l'air, ou plus précisément de l'oxygène, qui les entoure. Les anaérobies obligatoires, comme Clostridioides difficile, ne supportent pas l'oxygène et meurent peu de temps après y avoir été exposés. Les bactéries aérotolérantes, comme Clostridium botulinum, ne peuvent pas utiliser l'oxygène et ne meurent ni ne se développent en sa présence. Les anaérobies facultatifs peuvent utiliser l'oxygène mais n'en ont pas besoin pour se développer, comme c'est le cas d'E. coli. Il existe également un groupe de bactéries microaérophiles, telles que Campylobacter, qui ont besoin d'un peu d'oxygène pour se développer, bien qu'en quantités beaucoup plus faibles (1 à 2 %) que dans l'air normal, mais qui peuvent être inhibées dans des conditions aérobies.

Pourquoi faut-il s'en préoccuper ? Plusieurs bactéries pathogènes ont ces exigences particulières en matière de croissance. Actuellement, les espèces de Campylobacter thermotolérantes inquiètent les professionnels de la santé publique. En moyenne, un poulet sur deux est infecté par Campylobacter, ce qui fait de la viande de volaille l'une des causes les plus courantes d'intoxication alimentaire. Dans l'Union européenne, les maladies causées par les espèces de Campylobacter sont deux fois plus fréquentes que celles causées par les salmonelles. Dans le groupe des anaérobies, une espèce de Clostridia telle que C. botulinum est responsable de la maladie d'origine alimentaire connue sous le nom de botulisme, souvent transmise par des aliments en conserve (c'est-à-dire pauvres en oxygène), dans lesquels C. botulinum peut se développer et produire le composé botulinum, qui est toxique pour l'homme. Une autre espèce de Clostridia, C. perfringens, est la source la plus courante d'intoxication alimentaire aux États-Unis et au Canada et provoque des symptômes tels que des crampes abdominales et des diarrhées. Le risque d'infection par C. perfringens est particulièrement lié aux aliments conservés ou stockés dans des conditions chaudes pendant de longues périodes, ce qui favorise leur croissance jusqu'à atteindre des nombres infectieux (104 cfu/g).

#3 La grande anomalie du comptage d'assiettes

Certaines estimations indiquent que seulement 1 % des bactéries peuvent être cultivées avec les connaissances et les techniques dont nous disposons actuellement. L'"anomalie du grand nombre de plaques" est le terme que nous utilisons pour décrire l'observation selon laquelle le nombre de cellules microscopiques est significativement plus élevé que le nombre correspondant d'"unités formatrices de colonies" sur les plaques de gélose. Quelques exemples illustrent bien ce phénomène : alors que 50 % des micro-organismes de la flore buccale peuvent être cultivés sur des plaques de gélose, la plupart des micro-organismes de la flore gastro-intestinale ne peuvent pas être cultivés du tout. Les raisons en sont multiples, mais la communauté d'organismes entourant l'espèce en question, y compris d'autres bactéries ainsi que des plantes et des animaux, peut jouer un rôle important.

Les méthodes de numération sur plaque aérobie reposent sur des milieux très généraux, qui ne permettent pas la croissance de la plupart des groupes de bactéries. Techniquement, cela ne fait pas vraiment partie de la grande anomalie de la numération sur plaque, car certaines bactéries sont capables de se développer sur des géloses spéciales dans des conditions particulières (telles que des conditions anaérobies ou microaérophiles).

Pourquoi vous en préoccuper ? La grande anomalie de la numération sur plaque ne pose pas de problèmes significatifs dans les essais quotidiens, car la numération sur plaque aérobie des micro-organismes indicateurs est spécifique à un environnement de production donné et, en tant que telle, est toujours relative à une base de référence établie pour cet environnement de production. Toutefois, les méthodes sur plaque prennent beaucoup de temps, car elles nécessitent une période d'incubation pouvant aller jusqu'à trois jours, en fonction du protocole en vigueur. Il existe des méthodes directes qui ne nécessitent pas d'étape de culture pour compter les bactéries ; les microscopes permettent d'obtenir une vue d'ensemble des bactéries, mais ils prennent également beaucoup de temps. Si les méthodes directes telles que la cytométrie de flux sont courantes dans les installations de traitement de l'eau, elles ne le sont pas dans l'industrie alimentaire.

#4 Les bactéries psychrotrophes

Les bactéries psychrotrophes peuvent se développer à des températures aussi basses que 0 °C, avec des températures optimales et maximales de croissance supérieures à 15 °C. Ces microbes sont donc particulièrement problématiques pour les denrées alimentaires et les boissons telles que la viande crue et le lait stockés à basse température pendant de longues périodes. Les groupes de bactéries psychrotrophes les plus fréquemment rencontrés dans les aliments sont les genres Gram négatif Pseudomonas, Aeromonas, Achromobacter, Serratia, Alcaligenes, Chromobacterium et Flavobacterium, ainsi que les genres Gram positif Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus et Microbacteria. Listeria monocytogenes et certaines souches de Clostridium botulinum sont également connues pour leur capacité à proliférer à des températures de réfrigération.

Pourquoi faut-il s'en préoccuper ? Les bactéries psychrotrophes sont des adultérants et peuvent réduire considérablement la qualité et la durée de conservation des aliments. Les installations de production et les réservoirs de stockage réfrigérés offrent un environnement favorable à la multiplication de ces espèces bactériennes. Dans le lait réfrigéré, par exemple, Pseudomonas fluorescens peut produire des protéases et des lipases. Les espèces appartenant au genre Pseudomonas sont donc considérées comme typiquement responsables des difficultés technologiques, car les protéases et les lipases qu'elles produisent peuvent entraîner la dégradation des graisses et des protéines du lait, ce qui donne au lait une couleur grisâtre et un goût amer. Les espèces de Pseudomonas sont les micro-organismes les plus souvent responsables de la détérioration de la viande réfrigérée stockée en aérobiose. Il est bien connu que les espèces Pseudomonas sont très robustes et capables de résister à des conditions environnementales stressantes qui inhiberaient la croissance d'autres micro-organismes d'altération. Dans la viande crue réfrigérée et emballée sous vide, la microflore est dominée dans la plupart des cas par des bactéries lactiques psychrotrophes. De plus, la croissance de pathogènes pendant le stockage réfrigéré peut entraîner des maladies graves.

#5 Biofilms

Les micro-organismes sont capables de coloniser des surfaces en formant une matrice polymérique dans laquelle plusieurs espèces microbiennes peuvent être présentes ; c'est ce que l'on appelle un biofilm. Il est prouvé que la capacité de former des biofilms et d'y survivre n'est pas limitée à des groupes spécifiques de micro-organismes. En fait, la grande majorité des bactéries sont capables de former des biofilms. Les biofilms peuvent donc être composés soit de monocultures, soit de plusieurs espèces différentes de micro-organismes. Certains chercheurs ont suggéré que la structure complexe des biofilms mixtes les rend plus stables et plus résistants aux produits chimiques de nettoyage. La population initiale qui se lie à la surface peut modifier les propriétés de cette surface, ce qui permet à celles qui viennent plus tard d'adhérer par association cellule-cellule ; dans certains cas, la fixation d'une deuxième espèce peut accroître la stabilité de la population du biofilm. Par exemple, des études montrent que L. monocytogenes est plus susceptible d'adhérer à l'acier en présence de Pseudomonas.

Pourquoi vous en préoccuper ? Les biofilms qui se forment sur les équipements de transformation des aliments et sur d'autres surfaces en contact avec les aliments constituent une source persistante de contamination, menaçant la qualité et la sécurité globales des produits alimentaires et pouvant entraîner des maladies d'origine alimentaire ainsi que des pertes économiques. On sait que les micro-organismes de détérioration sont responsables de près d'un tiers des pertes dans les chaînes d'approvisionnement alimentaire, ce qui fait de la prévention et du contrôle des biofilms une priorité dans l'industrie alimentaire. Les micro-organismes qui se forment ou se développent en biofilms sont plus résistants à la désinfection, ce qui les rend problématiques dans un grand nombre d'industries alimentaires. D'autres effets des biofilms, tels que la corrosion des surfaces métalliques, constituent également une préoccupation majeure dans l'industrie alimentaire. Dans les deux cas, la présence de biofilms dans une usine alimentaire met la santé humaine en danger. Le degré de risque dépend de l'espèce bactérienne qui forme cette structure vivante tridimensionnelle.

Comment combler ces lacunes ? Le potentiel de la cytométrie en flux Les producteurs de denrées alimentaires n'ont généralement pas beaucoup d'options à leur disposition. Celles qui offrent un minimum de précision, comme la coloration vitale en combinaison avec des microscopes, permettent de quantifier les bactéries VBNC, mais elles prennent du temps et nécessitent un équipement spécial. Tous les groupes de bactéries anaérobies et microaérophiles - à l'exception notable des anaérobies facultatifs - peuvent se développer sur des plaques de gélose classiques, mais uniquement à des niveaux d'oxygène soigneusement contrôlés.

Cependant, les plaques d'agar ne sont pas une panacée. Elles ne permettent de dénombrer qu'environ 1 % des espèces connues de bactéries et mettent des jours à donner des résultats - jusqu'à 10 jours dans le cas des bactéries psychrotrophes. Les méthodes ATP, bien que rapides, ne permettent pas de quantifier les bactéries et ne sont que d'une utilité limitée pour la détection des bactéries dans les biofilms ; les données cinétiques des cellules planctoniques en suspension libre ne doivent pas être utilisées comme référence, car la libération d'ATP est beaucoup plus faible dans les biofilms. En outre, les traces d'ATP provenant de résidus alimentaires ou de champignons peuvent facilement éclipser l'ATP libéré par les bactéries, car les cellules eucaryotes contiennent 10 millions de fois plus d'ATP que les cellules procaryotes. En conséquence, les dispositifs ATP utilisés pour détecter les biofilms ont généralement une limite de détection beaucoup plus élevée, ce qui signifie qu'ils ne sont pas aussi sensibles que lorsqu'ils détectent des bactéries flottantes.

Chacun de ces cinq cas a montré à quel point il peut être difficile de détecter les bactéries et les résidus sur les surfaces de production alimentaire ; les lacunes des méthodes de détection les plus courantes, telles que les tests d'ensemencement et d'ATP, sont aussi tenaces que bien documentées.

Que peuvent faire les producteurs de denrées alimentaires pour combler les lacunes laissées par les méthodes culturales et les tests ATP ? Dans l'article suivant, mon collègue Cristian Ilea examine le potentiel de la cytométrie de flux par impédance et du cytomètre de flux CytoQuant®, une nouvelle solution qui quantifie immédiatement les bactéries et les particules de résidus sur les surfaces.