7 Dinge, die Sie unbedingt über Mykotoxin-Referenzmaterialien wissen müssen

Qualifizierte Referenzmaterialien sind eine Voraussetzung für die erfolgreiche Qualifizierung und Quantifizierung in der analytischen Chemie. Aber wie werden sie hergestellt? Wie können Sie sicher sein, dass sie die Qualitätsstandards erfüllen, die Ihr Labor benötigt? Was sind zertifizierte Referenzmaterialien? Wie können Sie das Zertifikat sinnvoll nutzen? Helmut Rost von Romer Labs beantwortet diese häufigen Fragen und mehr.

1. Warum brauchen wir Referenzmaterialien?

Die kurze Antwort lautet, dass die Regulierungs- und Zertifizierungsbehörden die Verwendung von Referenzmaterialien in den Labors vorschreiben oder empfehlen. Die Vereinigten Staaten und die Europäische Union1 beispielsweise regeln mehrere Mykotoxine, indem sie Höchstwerte für diese Kontaminanten in Futter- und Lebensmitteln festlegen. Darüber hinaus müssen Laboratorien, die nach ISO 17025 akkreditiert sind, qualifizierte und kompetente Referenzmaterialien verwenden, um ihre Akkreditierung aufrechtzuerhalten.

Die etwas längere Antwort lautet, dass die Labors Referenzmaterialien verwenden, um die Zuverlässigkeit ihrer Ergebnisse zu erhöhen. In den letzten Jahrzehnten hat die Analyse von Kontaminanten wie Mykotoxinen bei der Charakterisierung und Bewertung von Lebens- und Futtermittelproben immer mehr an Bedeutung gewonnen. Referenzmaterialien sind Substanzen mit definierten Eigenschaften, wie z.B. Aflatoxin B1, gelöst in Acetonitril in einer Konzentration von 2 µg/mL. Die spezifischen Eigenschaften eines Referenzmaterials - und, was besonders wichtig ist, seine relative Reinheit - bieten einen Maßstab, anhand dessen Labortechniker die Genauigkeit ihrer eigenen Ergebnisse bestätigen können.

2. Wie wird ein Referenzmaterial definiert?

Ein Referenzmaterial ist hinreichend homogen und stabil in Bezug auf seine spezifizierte Eigenschaft; es hat beispielsweise einen bestimmten prozentualen Reinheitsgrad eines Mykotoxins oder von Mykotoxinen als Feststoff oder eine bestimmte Konzentration als flüssiger Standard. Diese Eigenschaften gewährleisten ihre Eignung für die Verwendung im Messverfahren. Referenzmaterialhersteller, die die Anforderungen der ISO 17034:2016 ("Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Referenzmaterialherstellern") erfüllen, gelten als kompetent. Der Text in der ISO-Norm listet die entsprechenden Anforderungen auf mehreren Dutzend Seiten zusammen mit weiterer Literatur auf.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Kandidatenmaterial in Bezug auf Identität und Reinheit gut charakterisiert sein muss, bevor es als Ausgangsmaterial für ein Referenzmaterial verwendet werden kann. Ein Produktionsplan sorgt für die korrekte Dokumentation aller produzierten Chargen. Langzeit- und Kurzzeitstabilitätstests bei verschiedenen Temperaturen müssen belegen, dass das Material bis zum angegebenen Verfallsdatum stabil ist. Ein Homogenitätstest für jede Charge bestätigt, dass das Material gleichmäßig in den Versandgefäßen verteilt ist. Alle Analysen müssen die Anforderungen der ISO 17025 erfüllen; eine Akkreditierung nach ISO 17034 bedeutet, dass das Labor mit seinen Analysemethoden nach ISO 17025 akkreditiert ist.

3. Wie werden Referenzmaterialien für Mykotoxinanalysen hergestellt?

Die Mehrzahl der Mykotoxine wird von drei Pilzgattungen produziert: Aspergillus, Penicillium und Fusarium. Ein Trägermaterial wird mit einer Pilzsuspension beimpft und über mehrere Wochen bebrütet. Während des Fermentationsprozesses werden Proben entnommen, um zu bestätigen, dass das gewünschte Mykotoxin gebildet wird. Die typische Ausbeute des Produktionsprozesses liegt bei mehreren Gramm Rohmykotoxin pro kg Trägermaterial und kann je nach Mykotoxin und dem jeweiligen Fermentationsprozess erheblich variieren.

Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, beginnt die eigentliche Arbeit: Der Labortechniker reinigt den sehr groben Rohextrakt. Er beginnt mit Filterungsprozessen und Flüssig-Flüssig-Extraktionen, um das Gewicht und das Volumen des Extrakts zu reduzieren und die wichtigsten Verunreinigungen zu entfernen. Der Schlüsselprozess der Reinigung besteht aus (halb-)präparativen chromatographischen Reinigungsschritten, bei denen Verunreinigungen und Nebenprodukte aufgrund eines unterschiedlichen Adsorptionsverhaltens in der Chromatographiesäule vom Hauptprodukt getrennt werden. Diese Arbeit erfordert ein hohes Maß an Können und Erfahrung, da jedes Mykotoxin seine eigenen Eigenschaften und sein eigenes Retentionsverhalten hat. Die Reinigung schließt mit dem Trocknen des Produkts, dem Wiegen und einer erneuten Qualitätskontrolle ab.

Eine spezielle Verwendung von Referenzmaterialien ist die Verwendung als Matrix-Referenzmaterialien (oder Qualitätskontrollmaterialien), die hauptsächlich aus einer Lebens- oder Futtermittelmatrix bestehen, die durch natürlich entstandene Mykotoxine kontaminiert ist. Ein Beispiel ist Mais mit Deoxynivalenol. Diese Materialien können als Qualitätskontrolle zur Unterstützung der Analyse bestimmter Lebens- und Futtermittelproben verwendet werden.

4. Warum ist es sinnvoll, isotopenmarkierte Referenzmaterialien für Mykotoxine zu verwenden?

Analytiker, die Massenspektrometrie einsetzen, messen isotopenmarkierten Referenzmaterialien große Bedeutung bei - und das zu Recht. Betrachten Sie sie als "Super-Referenzmaterialien" für die Massenspektrometrie. Sie können alles, was nicht isotopenmarkierte Materialien können, und noch viel mehr. Sie kompensieren beispielsweise unerwünschte Effekte wie eine verminderte Extraktionseffizienz, eine niedrige Wiederfindung oder das Verhalten der Matrix bei der Analyse der Analyten und sind daher für die Einrichtung jedes Analyseverfahrens unerlässlich. Isotopen-markierte Referenzmaterialien werden wie oben beschrieben hergestellt, mit einem wichtigen Unterschied: die 12C-Atome werden durch 13C-Atome ersetzt. Daher haben isotopenmarkierte Produkte das gleiche physikalische und chemische Verhalten wie die unmarkierten Analyten. Sie werden vor der Analyse zugegeben und durchlaufen das gleiche Verfahren, gleichen aber eine Über- oder Unterschätzung der nicht markierten Mykotoxine aus.

5. Wie überprüfen Sie die Qualität der Referenzmaterialien?

Die Reinheit, d.h. die Qualität des Produkts, ist von größter Bedeutung und sollte so hoch wie möglich sein, d.h. mehr als 95% betragen. Während wiederkehrende Produkte mit der Vorläufercharge verglichen werden können, um ihre Qualität zu überprüfen, muss ein neues Produkt einer viel umfassenderen Charakterisierung unterzogen werden. Diese Art der Charakterisierung fester Materialien kann mehrere hochselektive und empfindliche Methoden umfassen: Die Strukturbestimmung durch Massenspektrometrie, Infrarotspektroskopie oder Kernspinresonanzspektroskopie kann uns über mögliche inhärente Verunreinigungen informieren.

In jedem Fall muss die Reinheit so genau und präzise wie möglich bestimmt werden. Die Verfügbarkeit eines zertifizierten Referenzmaterials kann ein großer Vorteil sein, da es die direkte Rückverfolgung des eigenen Referenzmaterials ermöglicht (siehe Nummer 6 unten). Die Standardmethode zur Bestimmung der Menge flüssiger Referenzmaterialien von Mykotoxinen (in einem Lösungsmittel gelöste Feststoffe) ist heute die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Verbindung mit einem geeigneten Detektor wie UV (Ultraviolett) oder FLD (Fluoreszenzdetektion). Diese Methode ist nahezu universell anwendbar, da die meisten Mykotoxine UV/FLD-empfindlich sind.

Bei isotopenmarkierten Substanzen kann das Verhältnis von 13C zu 12C (auch bekannt als Isotopenmuster) durch einen Scan mit erhöhter Auflösung mit einem Massenspektrometer bestimmt werden; die Isotopenreinheit von 13C sollte mehr als 98% betragen.

Die Laboratorien, die die Eigenschaft eines Referenzmaterials bestimmen, sollten gemäß ISO 17025 ("Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien") akkreditiert sein. Da ISO 17025-zertifizierte Laboratorien die Anforderung der messtechnischen Rückverfolgbarkeit erfüllen, können ihre Ergebnisse zur Angabe eines zertifizierten Referenzmaterials verwendet werden.

6. Was ist ein zertifiziertes Referenzmaterial?

Hier erreichen wir die höchste Stufe der Standardisierung. Ein zertifiziertes Referenzmaterial ist durch ein metrologisch gültiges Verfahren für seine Eigenschaft (wie z.B. % Reinheit oder Konzentration) gekennzeichnet und wird von einem Zertifikat begleitet, das den zertifizierten Wert zusammen mit der berechneten Unsicherheit dieses Wertes angibt. Das bedeutet, dass es zwischen Referenzmaterialien und zertifizierten Referenzmaterialien Unterschiede in Bezug auf Rückverfolgbarkeit und Unsicherheit gibt. In der täglichen Arbeit eines Labors werden in der Regel Referenzmaterialien verwendet. Wenn ein Referenzmaterial zurückverfolgt werden muss, kann das zertifizierte Referenzmaterial mit seiner metrologischen Rückverfolgbarkeit als Referenz verwendet werden. Allerdings gibt es derzeit nur für einige wenige Mykotoxine zertifizierte Referenzmaterialien.

7. Wie lesen Sie das Zertifikat?

Ein qualifiziertes Zertifikat enthält die notwendigen Informationen über das Referenzmaterial. Es enthält in der Regel die Beschreibung des Produkts mit Chargennummer und Verfallsdatum, den Lieferanten mit Adresse, den Gefahrenhinweis, den Verwendungszweck, Anweisungen für die korrekte Verwendung, die Lagerbedingungen und vor allem den Referenzwert.

Das Verfallsdatum gilt für das ungeöffnete Produkt unter den festgelegten Lagerungsbedingungen. Für zertifizierte Referenzmaterialien dokumentiert das Zertifikat einige weitere Merkmale: den zertifizierten Wert, das Unsicherheitsbudget und die Diskussion über die metrologische Rückverfolgbarkeit. Die Unsicherheit wird auf der Grundlage von Faktoren wie der Reinheit und der Zubereitung des Produkts und - falls nicht vernachlässigbar - seiner Stabilität und Homogenität berechnet (siehe den Artikel "Bestimmte Unsicherheiten" für weitere Informationen zur Berechnung und Verwendung von Unsicherheitswerten). Der zertifizierte Wert wird durch eine Analyse bestätigt, bei der die Kalibrierung gegen eine unabhängig hergestellte Referenzcharge des Zielanalyten durchgeführt wird.

 ¹ EU 2023/915, EU 2024/1022, EU 2024/1038