Herausforderungen bei Allergentests - Spiking und Wiederfindungen

Als ich mit der Entwicklung von Immunoassays für den Nachweis von Allergenen in Lebensmitteln begann, fiel mir als erstes die große Bandbreite an verschiedenen Lebensmitteltypen oder Matrices auf, mit denen die Assays arbeiten mussten. Da ich aus dem Bereich der medizinischen Immunoassays komme, gab es nur eine begrenzte Anzahl verschiedener Matrices, mit denen ich arbeiten konnte. In meinem Fall war dies Blutserum. Bei Lebensmitteln gibt es eine fast unendliche Anzahl verschiedener Probentypen, die alle ihre eigenen spezifischen Eigenschaften haben.
 

Wie wähle ich das richtige Testkit?

Wie können wir also sicherstellen, dass das hergestellte Testkit für die Verwendung mit einer so vielfältigen und anspruchsvollen Palette von Proben geeignet ist? An dieser Stelle kommt die Probenvalidierung ins Spiel. Bei diesem Prozess wird eine bekannte Menge eines Allergens von Interesse zu unserer Matrix hinzugefügt (Spike) und dann versucht, das Allergen wieder herauszuholen (Wiederfindung). Wichtig ist, dass, wie der Name schon sagt, Immunoassays biologische Komponenten (Antikörper) verwenden, um die allergenen Proteine von Interesse nachzuweisen. Wie bei allen biologischen Systemen sind die Kits empfindlich gegenüber Extremen. Im Falle von Lebensmitteln funktionieren die Kits in Gegenwart von starken Säuren oder Laugen, hohem Salzgehalt, hohem Fettgehalt usw. möglicherweise nicht wie gewünscht. Viele dieser Extreme können während des Extraktionsprozesses ausgeglichen werden. Die Kits verwenden daher ein gepuffertes System, um mit Änderungen des pH-Werts fertig zu werden, und die Zugabe des Puffers zur Probe hilft, einige der anderen Probleme wie Salz und Fett zu reduzieren und zu verdünnen.
 

Ist meine Wiederfindung akzeptabel?

Was ist akzeptabel, wenn es um die Wiederfindung einer bekannten Menge eines Allergens aus einer Probenmatrix geht? Bevor wir diese Frage beantworten können, müssen wir definieren, von wo wir ausgehen. Handelt es sich um eine angefallene Probe oder um eine aufgestockte Probe?

Aufgenommene Proben sind definiert als Proben, denen während der Verarbeitung eine bekannte Menge des Lebensmittelallergens zugesetzt wurde, wobei die tatsächlichen Bedingungen, unter denen die Probenmatrix normalerweise hergestellt wird, so gut wie möglich nachgeahmt werden.

Das Thema der entstandenen Proben wird in einer späteren Ausgabe von Spot On ausführlicher behandelt. In diesem Artikel werde ich mich darauf konzentrieren, eine leichter zugängliche Methode zu beschreiben, bei der eine bekannte Menge des Allergens in eine Matrix eingebracht wird, die Sie vom Lieferanten oder Hersteller erhalten haben, und die Wiederfindung zu messen.

In Bezug auf die Wiederfindung heißt es in den Leitlinien:

"Die ideale prozentuale Wiederfindungsrate liegt zwischen 80 und 120%. Die Wiederfindungsraten werden sowohl durch die Effizienz des Extraktionsschritts als auch durch das ELISA-Verfahren beeinflusst.

"Bei ELISA-Methoden für Lebensmittelallergene ist diese Wiederfindungsrate nicht immer möglich, insbesondere wenn bestimmte schwierige Matrices analysiert werden. Darüber hinaus kann sich die Wiederfindung aus angefallenen Proben erheblich von derjenigen unterscheiden, die mit aufgestockten Proben erzielt wird.

"Aus diesem Grund werden Wiederfindungsraten zwischen 50 und 150% als akzeptabel angesehen, solange sie nachweislich konsistent sind.

Die Richtlinien wurden 2010 von der Association of Analytical Communities (AOAC) veröffentlicht und beziehen sich insbesondere auf quantitative ELISA-Methoden (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Viele der wichtigsten Punkte sind auch auf qualitative oder halbquantitative LFD-Methoden (Lateral Flow Device) anwendbar.
 

Die "Wissenschaft" hinter dem Spiking

Wenn wir ein neues Lebensmittel erhalten oder auf ein neues Lebensmittel stoßen, das noch nicht getestet wurde, führen wir eine Spike-Recovery-Validierung durch, um sicherzustellen, dass es mit unseren Testkits richtig funktioniert. Wir setzen Spikes mit drei verschiedenen Allergenkonzentrationen ein - niedrig, mittel und hoch - um den Nachweisbereich des Tests abzudecken.

Der niedrige Allergenspike liegt in der Nähe der unteren Quantifizierungsgrenze (LLOQ) des ELISA (in diesem Fall der niedrigste Kalibratorwert über 0 ppm) oder in der Nähe der Nachweisgrenze (LOD) eines Lateral Flow-Geräts. Der mittlere Spike liegt in der Mitte der ELISA-Kalibrierungskurve und der hohe Spike liegt an oder in der Nähe der oberen Bestimmungsgrenze (ULOQ) (der Kalibrator mit dem höchsten ppm-Wert). Die Probe wird gemäß der mit dem Kit gelieferten Produktbeilage extrahiert und getestet.

Wenn wir also zum Beispiel 5 ppm Mandeln in Schokolade geben, erwarten wir eine Wiederfindung von 4 bis 6 ppm. Wenn das Ergebnis außerhalb dieses Bereichs liegt, können Sie Maßnahmen ergreifen, um die Wiederfindung zu verbessern. Schokolade ist erfahrungsgemäß eine der schwierigsten Lebensmittelmatrizen, die zu testen sind. Sie ist reich an Tanninen und anderen Polyphenolen, die sich an eventuell vorhandene allergene Proteine binden und unlösliche Komplexe bilden können, die nur schwer zu extrahieren sind.

Solche Schwierigkeiten können durch die Zugabe von zusätzlichem Protein zum Extraktionspuffer überwunden werden. Das überschüssige Protein bindet an die Polyphenole und macht die Allergene für die Extraktion verfügbar. Mein Protein der Wahl ist Fischgelatine, obwohl auch andere Materialien wie Milchpulver verwendet werden können, um die Extraktion von Lebensmitteln mit hohem Polyphenolgehalt zu verbessern. Achten Sie bei der Verwendung von Milchpulver darauf, dass Sie Ihren Laborraum nicht kontaminieren, insbesondere wenn Sie Milchallergene testen.

Lateral Flow Devices, oder Streifen oder Dipsticks, wie sie manchmal genannt werden, können auf ähnliche Weise wie ein Allergen-ELISA-Testkit für die Spike-Wiedergewinnung validiert werden. Bei der Auswahl eines hohen Spike-Wertes sollten Sie beachten, dass LFDs zwar in der Lage sind, sehr hohe ppm-Werte nachzuweisen, Sie das Gerät aber auch überlasten können, indem Sie zu viel Allergen hinzufügen. Dies kann bei Mengen von mehr als 1% des allergenen Lebensmittels der Fall sein.
 

Aufrechterhaltung von Qualität und Testpräzision

Es kann für einen Kit-Hersteller notwendig sein, eng mit Kunden zusammenzuarbeiten, die routinemäßig schwierige Lebensmittelmatrixen testen. Es ist wichtig, sich zu vergewissern, dass der Testsatz wie gewünscht und zur Zufriedenheit des Kunden funktioniert. Dies kann, wie oben beschrieben, durch die Durchführung von Experimenten zur Wiederherstellung von Allergenspikes in der problematischen Matrix erreicht werden.

In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Standardmethode des Kits zu modifizieren oder zu ändern, um den Anforderungen der Probe und/oder des Kunden gerecht zu werden. Dies sollte immer unter Anleitung des Kit-Herstellers erfolgen, um die Qualität und Reproduzierbarkeit des Testkits zu gewährleisten.