Herstellung von flüssigen Mykotoxin-Kalibranten: Ein Blick hinter die Kulissen

Referenzmaterialien oder Kalibriermittel beschreiben Substanzen oder Objekte mit einem oder mehreren definierten charakteristischen Eigenschaftswert(en), die als Maß oder als Benchmark für Messmethoden verwendet werden. Angesichts der Bedeutung der Verbrauchersicherheit für die Lebens- und Futtermittelindustrie werden bei Mykotoxin-Tests Referenzmaterialien verwendet, um genaue und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten.
 

Allgegenwärtige Gefahr

Mykotoxine sind natürlich vorkommende sekundäre Pilzmetaboliten, die für Tiere und Menschen giftig sind. Schimmelpilze wachsen auf dem Feld und während der Lagerung. Sie sind in fast allen landwirtschaftlichen Erzeugnissen weltweit zu finden. Es wurden mehr als 380 Mykotoxine identifiziert, und die Toxizität der einzelnen Substanzen ist sehr unterschiedlich. Die festgelegten zulässigen Höchstkonzentrationen verschiedener Mykotoxine in pflanzlichen Rohstoffen wie Getreide, Weizen, Mais - um nur einige zu nennen - haben die Rohstoffproduzenten dazu gezwungen, ihre Proben in einem Analyselabor sorgfältig zu untersuchen, um sich der Qualität ihrer Produkte sicher zu sein.
 

Gravimetrische Vorbereitung

Häufig kann ein Pilz, der unter optimalen Bedingungen wächst - ausreichend warme Temperaturen, hohe Luftfeuchtigkeit und ein geeignetes Substrat - Mykotoxine produzieren. Im Labor beginnt die Geschichte eines Referenzmaterials mit dem Versuch, die künstlichen Wachstumsbedingungen so anzupassen, dass optimale Mykotoxinausbeuten erzielt werden. Dazu gehört auch die Verwendung einer geeigneten Pilzgattung - denn jeder Pilz produziert sein eigenes charakteristisches Muster von Metaboliten, das in die Hunderte gehen kann. Die Pflege von Pilzstämmen für die Produktion ist entscheidend. Ihre Vitalität und Funktionalität werden ständig überwacht, da dies die Grundlage aller Aktivitäten für die Produktionsprozesse des Referenzmaterials bildet. Schimmelpilze sind lebende Organismen, die im Laufe der Zeit mutieren oder sogar degenerieren können, was zu einem Rückgang der Mykotoxinausbeute führt. Nach einer gewissen Lagerzeit können sich neue Metaboliten bilden, was den Isolierungsprozess ebenfalls stark beeinflussen kann. Die Stämme müssen regelmäßig erneuert werden, um Mutationen, Verunreinigungen oder anderen unerwünschten Eigenschaften entgegenzuwirken.

Beim ersten Schritt, der Fermentation, kommt es darauf an, dem Pilz die Laborumgebung buchstäblich so schmackhaft wie möglich zu machen, um sein Wachstum zu fördern. Die optimalen Medien variieren auch von Stamm zu Stamm, so dass Komponenten wie Salze und Mineralien als Nährstoffquelle bereitgestellt werden. Man lässt den Schimmelpilz eine bestimmte Zeit lang wachsen - von einigen Tagen bis zu einigen Wochen - während der der Pilz sein Medium verstoffwechselt.

Nach Abschluss der Fermentation und einer sorgfältigen Kontrolle des Prozesses wird das Mykotoxin mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel aus dem Kulturmaterial extrahiert. Je nach Molekularstruktur kann es sich dabei um polare oder unpolare organische Lösungsmittel handeln. Während der Fermentation produzieren Schimmelpilze neben dem interessierenden Toxin meist auch Verunreinigungen, z.B. andere Metaboliten, Farbstoffe, Öle usw.

Der resultierende Rohextrakt enthält oft viele Verunreinigungen. Während der Isolierung oder Reinigung wird das Mykotoxin durch verschiedene chromatographische und präparative Anwendungen mit unterschiedlicher Selektivität schrittweise an die angestrebte Reinheit von >98% herangeführt. Einige Toxine haben günstige Molekularstrukturen und können aus einer übersättigten Lösung von polaren oder apolaren organischen Lösungsmitteln kristallisiert werden. Dies geschieht z.B. durch Abkühlen der Lösung, durch Verdampfen des Kristallisationsmittels oder durch Mischen mehrerer Lösungsmittel unterschiedlicher Polarität. Andere Toxine können durch Gefriertrocknung in kristalline, pulverförmige Form gebracht werden. Durch die Kristallisation wird die Reinheit des Toxins wieder erhöht, bis die angestrebte Reinheit erreicht ist.
 

Qualitätskontrolle

HPLC, UV-Photometer und HPLC-MS werden eingesetzt, um die Reinheit des produzierten Rohmaterials zu bestimmen/bestätigen. Je nach Toxin kann dies beispielsweise durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Kombination mit Diodenarray-Detektion, Fluoreszenzdetektion oder ähnlichem, mit UV-Photometer (qualitative und quantitative Analyse der Verbindung) oder durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Kombination mit Massenspektrometriedetektion erfolgen. MS ist insbesondere für die oben beschriebene Bestimmung der Isotopenreinheit (z.B. > 98% 13C-Atome) von 13C-Isotopen-markierten Mykotoxinen erforderlich. Mykotoxin-Referenzmaterialien nehmen auf dem Markt eine Nischenposition ein. Daher ist es manchmal schwierig, Vergleichssubstanzen zu finden, die im Handel erhältlich sind und für die Prozesskontrolle während der Produktion und für Qualitätskontrollen verwendet werden können.
 

Lieferung

Nachdem das feste Mykotoxin die abschließende Qualitätskontrolle bestanden hat, wird es zur Verwendung als flüssiges Mykotoxin-Referenzmaterial verflüssigt. Die flüssige Kalibrierlösung wird dann in Flaschen abgefüllt und es wird ein Analysezertifikat erstellt, das den Eigenschaftswert und seine Unsicherheit angibt und das jedem einzelnen Kalibriermittel beiliegt.