Impedanz-Durchflusszytometrie und ihre Verwendung bei der Überwachung von Lebensmittelverarbeitungsumgebungen
Was ist Durchflusszytometrie?
Die Durchflusszytometrie bezieht sich auf eine Gruppe von Techniken, die einen Laser oder ein elektrisches Feld verwenden, um in einer Flüssigkeit suspendierte Zellen zu zählen und einige ihrer physikalischen oder chemischen Eigenschaften zu bestimmen. Im Idealfall fließt jeweils nur eine Zelle durch den mikrofluidischen Kanal des Zytometers, der die Veränderungen der Wellenlänge des Lichts oder der elektrischen Ladung beim Durchgang jeder Zelle oder anderer Partikel erfasst. Da die Durchflusszytometrie in der Regel große und teure Geräte sowie anspruchsvolle Vorbereitungsschritte erfordert, ist die Methode traditionell auf den Laborgebrauch in Anwendungsbereichen wie Forschung und Medizin beschränkt.
Veröffentlicht am:
Mikrobiologie
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Einsatz der Impedanz-Durchflusszytometrie zur Zählung von Zellen und Rückstandspartikeln
Die Impedanz-Durchflusszytometrie basiert auf der Technologie der Coulter-Partikelzähler, die in Elektrolyten suspendierte Partikel auf der Grundlage von Impedanzänderungen, die durch die Verdrängung der Elektrolyte durch die Partikel verursacht werden, messen und zählen können. Durch die gleichzeitige Messung mehrerer Frequenzen für jedes vorbeiziehende Partikel kann die Impedanz-Durchflusszytometrie die Partikel nicht nur anhand ihrer Größe, sondern auch anhand ihrer elektrischen Eigenschaften unterscheiden. Dies ist eine leistungsstarke Variante der Durchflusszytometrie, da sie sehr robust ist und zur Bewertung zellulärer Eigenschaften verwendet werden kann, die sonst ohne den Einsatz molekularer Marker nicht messbar sind, wie z.B. die Integrität der Zellmembran. Ein Impedanz-Durchflusszytometer verwendet daher anstelle eines Lasers einen Wechselstrom, dessen unterschiedliche Frequenzen es dem Gerät ermöglichen, membranintakte Zellen und andere Partikel zu erkennen, ihre Größe zu messen und separat zu zählen. Im Vergleich zu anderen durchflusszytometrischen Geräten sind Impedanz-Durchflusszytometer leicht, tragbar und batteriebetrieben, so dass sie dort eingesetzt werden können, wo die Probe entnommen wird.
Wie unterscheiden Impedanz-Durchflusszytometer zwischen Zellen und anderen Partikeln?
Die Impedanz-Durchflusszytometrie macht sich die einzigartigen elektromagnetischen Eigenschaften der Zellmembran und des Zytoplasmas zunutze, um Bakterien von anderen Partikeln zu unterscheiden. Die Zellmembran und das Zytoplasma einer Zelle beeinflussen das elektrische Feld auf eine Weise, die sich von der anderer Partikel in der Probe unterscheidet. Ein Beispiel mit metallischen (leitenden) Partikeln, nicht leitenden Partikeln und intakten Zellen kann dieses Prinzip am deutlichsten veranschaulichen. Unabhängig von der Frequenz des elektrischen Feldes lässt die Leitfähigkeit von metallischen Partikeln das elektrische Feld ungehindert passieren. Im Gegensatz dazu widerstehen nicht leitende Partikel wie Polystyrol dem elektrischen Feld; der Strom bewegt sich nur im flüssigen Medium fort, was zu einer messbaren Volumenverschiebung führt, die mit den Partikeln im Strömungskanal korreliert. Intakte Zellen sind jedoch insofern einzigartig, als sie je nach der Frequenz des elektrischen Feldes sowohl nichtleitenden als auch metallischen Partikeln ähneln. Bei niedrigen Frequenzen verhindert die isolierende Eigenschaft der Zellmembran, dass das elektrische Feld in die Zelle eindringt, was zu der gleichen Art von Verschiebung wie bei nichtleitenden Partikeln führt. Bei höheren Frequenzen kann die Membran jedoch teilweise durchdrungen werden, so dass Zellen eine ähnliche Leitfähigkeit wie metallische Partikel aufweisen. Die Mikroelektroden in Impedanz-Durchflusszytometern erzeugen sowohl bei niedrigen als auch bei hohen Frequenzen Felder, die es dem Gerät ermöglichen, diese Änderungen in der Leitfähigkeit und im Widerstand zu erkennen und sie in präziser Anzahl entweder intakten Zellen oder anderen Partikeln zuzuordnen. Der Detektor identifiziert das Ziel als Bakterium auf der Grundlage des unterschiedlichen Grades der Impedanz oder Leitfähigkeit bei diesen Frequenzen. Der Benutzer erhält dann getrennte Zählungen von intakten Zellen und anderen Partikeln.
Wie ist die Impedanz-Durchflusszytometrie im Vergleich zu kulturellen Methoden?
Kulturelle Methoden, insbesondere die Verwendung von Agarplatten, sind der traditionelle Ansatz zur Überwachung der Hygiene in der Lebensmittelverarbeitung. Kulturelle Methoden sind zwar gut etabliert, haben aber einige Nachteile in Bezug auf ihre Geschwindigkeit und ihren Umfang. Kulturelle Methoden sind langsam und benötigen zwischen einem und zehn Tagen, bis sich Bakterien zu zählbaren Kolonien entwickelt haben. Diese Methoden messen nur das, was unter den spezifischen Bedingungen eines bestimmten Testlaufs kultivierbar ist. Eine Spezies oder eine andere Bakteriengruppe kann einen bestimmten Agar oder ein bestimmtes flüssiges Medium bei einer exakten Temperatur, einem bestimmten Lichtgrad oder einer bestimmten Luftfeuchtigkeit benötigen, um nur einige Variablen zu nennen. Kulturelle Methoden können auch keinen Anspruch auf eine umfassende Messung aller Bakterien in einer Probe erheben. Die "große Anomalie der Plattenzählung", ein in der Mikrobiologie wohlbekanntes Rätsel, besagt, dass nur ein kleiner Teil der Bakterien in einem Habitat durch Kultivierung gewonnen werden kann. Bakterien in einem lebensfähigen, aber nicht kultivierbaren Zustand (VBNC) sind lebendig, können aber aufgrund von Stress, Eigenheiten oder nicht optimalen Umweltfaktoren nicht auf Agar oder in flüssigen Medien wachsen. In einigen Fällen können sie nach der Wiederbelebung kultiviert werden, ein Prozess, der wiederum zeitaufwendig ist. Von einigen pathogenen Bakterien wie E. coli O157 ist bekannt, dass sie in einen VBNC-Zustand übergehen, um sich dann in späteren Stadien der Nahrungskette oder in menschlichen Wirten zu vermehren, nachdem sie aufgenommen wurden. Die Bakterien dieser Gruppen, die kultiviert werden können, erfordern besondere Inkubationsbedingungen, was die Kosten für analytische Tests erhöht. Impedanz-Durchflusszytometer zählen alle Bakterien, die den Durchflusskanal passieren, unabhängig von ihrem Zustand (kultivierbar, VBNC, nicht kultivierbar, ruhend) oder ihren Wachstumsanforderungen. Eine solche direkte, unmittelbare Quantifizierung erweitert den Anwendungsbereich eines Hygienekontrollprogramms. Bakterien, die sich erst vermehren, wenn sie mit Lebensmitteln oder potenziellen Wirten in Berührung kommen, können ebenfalls mit der Impedanz-Durchflusszytometrie erfasst werden. Außerdem können Sie sofort Maßnahmen ergreifen, wenn die Reinigung und Desinfektion nicht nach Plan verläuft.