Nicht die üblichen Verdächtigen: 5 Lücken in Ihrem Umweltüberwachungsprogramm

Selbst die am besten geplanten Überwachungsprogramme für Reinigung und Desinfektion haben ihre blinden Flecken. Stefan Widmann wirft einen genaueren Blick auf fünf der wahrscheinlichsten - und gefährlichsten - Lücken in Ihrem Umweltüberwachungsprogramm und erklärt, was sie sind, warum Sie sich darum kümmern sollten und was Sie dagegen tun können.

#1 Lebensfähige, aber nicht kultivierbare (VBNC) Mikroorganismen

Lange Zeit nahmen Mikrobiologen an, dass alle Bakterien, die auf normalen Kulturmedien nicht wachsen, tot sind. Spätere Forschungen ergaben, dass es neben kulturfähig und tot noch einen dritten Zustand gibt: lebensfähig, aber nicht kulturfähig (VBNC).

Im Allgemeinen vermehren sich Bakterien im VBNC-Zustand nicht, sind aber immer noch lebendig, was sich an ihrer Stoffwechselaktivität zeigt. Am wichtigsten für uns ist die Tatsache, dass sie nach der Wiederbelebung kulturfähig werden und sich somit in Lebensmitteln vermehren können. Darüber hinaus wachsen einige pathogene Bakterien in Abwesenheit eines Wirtes nicht und müssen nur in der Nahrung bis zur Aufnahme überleben, um Krankheiten zu verursachen.

Es gibt viele Gründe, warum Bakterien in den VBNC-Zustand übergehen können; Hunger, Inkubation außerhalb des für das Wachstum optimalen Temperaturbereichs, erhöhte osmotische Konzentrationen, hohe Sauerstoffkonzentrationen oder Exposition gegenüber weißem Licht sind nur einige davon. Die spezifischen Eigenschaften des betreffenden Bakterienstamms bestimmen, was genau die Bakterien in diesen Zustand versetzt.

Warum sollte Sie das interessieren?
Einige Bakterien, die in den VBNC-Zustand übergehen können, sind für die Lebensmittelherstellung von Bedeutung. Wir kennen zwar noch nicht alle Bakterienarten, die in den VBNC-Zustand übergehen können, aber wir kennen einige, die dies tun. Dazu gehören Indikatororganismen (wie Klebsiella aerogenes und Klebsiella pneumoniae), Verfälscher (wie Lactobacillus plantarum und Lactococcus lactis) und Krankheitserreger (wie Salmonella Typhimurium, Campylobacter coli oder Listeria monocytogenes).

Nachdem wir sie identifiziert haben, müssen wir uns nun fragen, ob diese Bakterien in einen vollständig kultivierbaren und potenziell pathogenen Zustand zurückkehren könnten. Mikrobiologen tappten bei dieser Frage lange Zeit im Dunkeln, da es schwierig ist, VBNC-Bakterien vollständig von kultivierbaren Bakterien zu trennen. Die Forscher haben dieses Problem zum Teil mit einem statistischen Ansatz gelöst: Sie verdünnen eine große Anzahl von VBNC-Bakterien so weit, dass kaum noch kultivierbare Bakterien übrig bleiben. Die Bakterien werden dann nach einer bestimmten Zeitspanne gezählt. Wenn ein starkes Wachstum beobachtet wird, ist die einzig mögliche Schlussfolgerung, dass die Bakterien den VBNC-Zustand verlassen haben und kultivierbar geworden sind.

Eine weitere Folgerung ist, dass sie, wenn sie in einen kultivierbaren Zustand zurückkehren können, auch wieder pathogen werden können. Es gibt Beispiele für genau dieses Phänomen, das zu Ausbrüchen führt. So wurden bei einem Ausbruch in Japan im Jahr 1997 VBNC E. coli O157 vermutet, da die Gesamtzahl der E. coli unbedeutend war und shigatoxigene Stämme wie O157 in sehr geringer Zahl Krankheiten verursachen konnten.

#2 Anaerobe und mikroaerophile Bakterien

Anaerobe Bakterien oder allgemeiner anaerobe Mikroorganismen lassen sich in drei Gruppen einteilen: obligat, aero-tolerant und fakultativ. Wie ihre Namen schon andeuten, haben sie jeweils besondere Anforderungen an die sie umgebende Luft, genauer gesagt, an den Sauerstoff. Obligate Anaerobier wie Clostridioides difficile werden durch Sauerstoff geschädigt und sterben kurz nach der Exposition. Lufttolerante Bakterien wie Clostridium botulinum können den Sauerstoff nicht verwerten und werden in seiner Gegenwart weder sterben noch wachsen. Fakultative Anaerobier können Sauerstoff nutzen, brauchen ihn aber nicht zum Wachstum, wie z.B. E. coli. Es gibt auch die Gruppe der mikroaerophilen Bakterien wie Campylobacter, die etwas Sauerstoff zum Wachstum benötigen, wenn auch in viel geringeren Mengen (1-2%) als in normaler Luft, aber unter aeroben Bedingungen gehemmt werden können.

Warum sollte Sie das interessieren?
Mehrere krankheitserregende Bakterien haben diese speziellen Wachstumsanforderungen. Gegenwärtig geben die thermotoleranten Campylobacter-Arten Anlass zur Sorge unter den Fachleuten des öffentlichen Gesundheitswesens. Im Durchschnitt ist jedes zweite Huhn mit Campylobacter infiziert, was Geflügelfleisch zu einer der häufigsten Ursachen für Lebensmittelvergiftungen macht. In der EU treten Krankheiten, die durch Campylobacter-Arten verursacht werden, doppelt so häufig auf wie solche, die durch Salmonellen verursacht werden. Aus der Gruppe der Anaerobier ist eine Clostridienart wie C. botulinum für die als Botulismus bekannte Lebensmittelkrankheit verantwortlich, die häufig durch konservierte (d.h. sauerstoffarme) Lebensmittel übertragen wird, in denen C. botulinum gedeihen und die für den Menschen giftige Verbindung Botulinum produzieren kann. Eine andere Clostridienart, C. perfringens, ist die häufigste Ursache für Lebensmittelvergiftungen in den USA und Kanada und verursacht Symptome wie Bauchkrämpfe und Durchfall. Das Risiko einer Infektion mit C. perfringens korreliert besonders stark mit Lebensmitteln, die über einen längeren Zeitraum hinweg warm gelagert oder aufbewahrt wurden, was ihr Wachstum auf eine infektiöse Anzahl (104 cfu/g) begünstigt.

#3 Die große Anomalie der Keimzahl

Einige Schätzungen gehen davon aus, dass nur 1% der Bakterien mit dem Wissen und den Techniken, die uns heute zur Verfügung stehen, kultiviert werden können. Die "Great Plate Count Anomaly" ist der Begriff, den wir verwenden, um die Beobachtung zu beschreiben, dass die mikroskopische Zellzahl deutlich höher ist als die entsprechende Zahl der "koloniebildenden Einheiten" auf Agarplatten. Ein paar Beispiele können dieses Phänomen am besten veranschaulichen: Während 50 % der Mikroorganismen der Mundflora mit Agarplatten kultiviert werden können, kann der größte Teil der Magen-Darm-Flora überhaupt nicht kultiviert werden. Die Gründe dafür sind vielfältig, aber die Organismengemeinschaft, die die betreffende Spezies umgibt, einschließlich anderer Bakterien sowie Pflanzen und Tiere, kann eine wichtige Rolle spielen.

Aerobe Plattenkulturen basieren auf sehr allgemeinen Medien, die das Wachstum der meisten Bakteriengruppen nicht unterstützen. Technisch gesehen ist dies nicht wirklich Teil der großen Anomalie der Plattenzählung, da einige Bakterien auf speziellen Agarplatten unter besonderen Bedingungen (wie anaeroben oder mikroaerophilen Bedingungen) wachsen können.

Warum sollte Sie das interessieren? Die große Anomalie der Keimzahl stellt bei den täglichen Testläufen kein großes Problem dar, da die aerobe Keimzahl für Indikatormikroorganismen spezifisch für eine bestimmte Produktionsumgebung ist und als solche immer relativ zu einer für diese Produktionsumgebung festgelegten Basislinie ist. Plattenmethoden sind jedoch sehr zeitaufwändig und erfordern je nach Protokoll eine Inkubationszeit von bis zu drei Tagen. Es gibt direkte Methoden, die keinen Kultivierungsschritt zur Zählung der Bakterien erfordern. Mikroskope bieten einen umfassenden Blick auf die Bakterien, sind aber ebenfalls sehr zeitaufwändig. Während direkte Methoden wie die Durchflusszytometrie in Wasseraufbereitungsanlagen üblich sind, sind sie in der Lebensmittelindustrie nicht üblich.

#4 Psychrotrophe Bakterien

Psychrotrophe Bakterien können bei Temperaturen von bis zu 0 °C wachsen, wobei die optimale und maximale Wachstumstemperatur über 15 °C liegt. Das macht solche Mikroben besonders problematisch für Lebensmittel und Getränke wie rohes Fleisch und Milch, die über längere Zeit bei niedrigen Temperaturen gelagert werden. Die am häufigsten in Lebensmitteln vorkommenden psychrotrophen Bakteriengruppen sind die gramnegativen Gattungen Pseudomonas, Aeromonas, Achromobacter, Serratia, Alcaligenes, Chromobacterium und Flavobacterium sowie grampositive Gattungen wie Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus und Microbacteria. Listeria monocytogenes und einige Stämme von Clostridium botulinum sind ebenfalls dafür bekannt, dass sie sich bei Kühltemperaturen vermehren können.

Warum sollte Sie das interessieren?
Psychrotrophe Bakterien sind Verfälschungsmittel und können die Qualität und Haltbarkeit von Lebensmitteln erheblich beeinträchtigen. Gekühlte Produktionsanlagen und Lagertanks bieten ein günstiges Umfeld für die Vermehrung dieser Bakterienarten. In gekühlter Milch kann zum Beispiel Pseudomonas fluorescens sowohl Proteasen als auch Lipasen produzieren. Daher gelten Arten der Gattung Pseudomonas als typischerweise verantwortlich für technologische Schwierigkeiten, da die von ihnen produzierten Proteasen und Lipasen den Abbau von Milchfett und -proteinen verursachen können, wodurch die Milch eine gräuliche Farbe und einen bitteren Geschmack erhält. Pseudomonas-Arten sind die Mikroorganismen, die am häufigsten für den Verderb in aerob gelagertem, gekühltem Fleisch verantwortlich sind. Es ist bekannt, dass Pseudomonas-Arten sehr robust sind und stressigen Umweltbedingungen widerstehen können, die das Wachstum anderer verderblicher Mikroorganismen hemmen würden. In vakuumverpacktem, gekühltem rohem Fleisch wird die Mikroflora in den meisten Fällen von psychrotrophen Milchsäurebakterien dominiert. Außerdem könnte das Wachstum von Krankheitserregern während der Kühllagerung zu schweren Erkrankungen führen.

#5 Biofilme

Mikroorganismen sind in der Lage, Oberflächen zu besiedeln, indem sie eine polymere Matrix bilden, in der mehrere mikrobielle Spezies vorhanden sein können; dies wird als Biofilm bezeichnet. Es gibt Hinweise darauf, dass die Fähigkeit, Biofilme zu bilden und darin zu überleben, nicht auf bestimmte Gruppen von Mikroorganismen beschränkt ist. Tatsächlich ist die große Mehrheit der Bakterien in der Lage, Biofilme zu bilden. Biofilme können daher entweder aus Monokulturen oder aus mehreren verschiedenen Mikroorganismenarten bestehen. Einige Forscher vermuten, dass die komplexe Struktur von gemischten Biofilmen diese stabiler und widerstandsfähiger gegen Reinigungschemikalien macht. Die erste Population, die sich an die Oberfläche bindet, kann die Eigenschaften dieser Oberfläche verändern, so dass die später hinzukommenden Mikroorganismen durch Zell-Zell-Assoziation anhaften können. Studien haben beispielsweise gezeigt, dass L. monocytogenes in Gegenwart von Pseudomonas eher an Stahl anhaftet.

Warum sollte Sie das interessieren?
Biofilme, die sich auf Lebensmittelverarbeitungsgeräten und anderen Oberflächen mit Lebensmittelkontakt bilden, stellen eine dauerhafte Kontaminationsquelle dar, die die Gesamtqualität und Sicherheit von Lebensmitteln gefährdet und möglicherweise zu lebensmittelbedingten Krankheiten sowie zu wirtschaftlichen Verlusten führt. Es ist bekannt, dass verderbliche Mikroorganismen für fast ein Drittel der Verluste in der Lebensmittelversorgungskette verantwortlich sind, so dass die Prävention und Kontrolle von Biofilmen in der Lebensmittelindustrie eine Priorität darstellt. Mikroorganismen, die Biofilme bilden oder darin gedeihen, sind resistenter gegen Desinfektionsmittel, was sie in einer Vielzahl von Lebensmittelindustrien problematisch macht. Andere Auswirkungen von Biofilmen, wie die Korrosion von Metalloberflächen, sind in der Lebensmittelindustrie ein weiteres kritisches Problem. In jedem Fall stellt das Vorhandensein von Biofilmen in einer Lebensmittelfabrik ein Risiko für die menschliche Gesundheit dar. Das Ausmaß des Risikos hängt von den Bakterienarten ab, die diese dreidimensionale, lebende Struktur bilden.

Wie kann man diese Lücken schließen? Das Potenzial der Durchflusszytometrie
Den Lebensmittelherstellern stehen im Allgemeinen nicht viele Möglichkeiten zur Verfügung. Diejenigen, die ein gewisses Maß an Präzision bieten, wie z.B. die Vitalfärbung in Kombination mit Mikroskopen, können VBNC-Bakterien quantifizieren, sind aber zeitaufwändig und erfordern eine spezielle Ausrüstung. Alle Gruppen von anaeroben und mikroaerophilen Bakterien - mit der bemerkenswerten Ausnahme der fakultativen Anaerobier - können auf klassischen Agarplatten wachsen, allerdings nur unter sorgfältig kontrolliertem Sauerstoffgehalt.

Doch Agarplatten sind kein Allheilmittel. Mit Agarplatten können nur etwa 1 % der bekannten Bakterienarten gezählt werden und es dauert Tage, bis die Ergebnisse vorliegen - bis zu 10 Tage im Fall von psychrotrophen Bakterien. ATP-Methoden sind zwar schnell, quantifizieren aber keine Bakterien und sind nur begrenzt geeignet, um Bakterien in Biofilmen nachzuweisen. Die kinetischen Daten von frei schwebenden planktonischen Zellen sollten nicht als Referenz verwendet werden, da die Freisetzung von ATP in Biofilmen viel geringer ist. Außerdem können ATP-Spuren, die von Nahrungsmittelresten oder Pilzen stammen, das von Bakterien freigesetzte ATP leicht überschatten, da eukaryotische Zellen 10 Millionen Mal mehr ATP enthalten als prokaryotische Zellen. Dementsprechend haben ATP-Geräte, die zum Nachweis von Biofilmen verwendet werden, in der Regel eine viel höhere Nachweisgrenze, was bedeutet, dass sie nicht so empfindlich sind, wie sie es beim Nachweis frei schwimmender Bakterien wären.

Jeder dieser fünf Fälle hat gezeigt, wie schwierig es sein kann, Bakterien und Rückstände auf Oberflächen in der Lebensmittelproduktion nachzuweisen. Die Unzulänglichkeiten der gängigsten Nachweismethoden, wie z.B. Ausstriche und ATP-Tests, sind ebenso hartnäckig wie gut dokumentiert.

Was können Lebensmittelhersteller tun, um die Lücken zu schließen, die kulturelle Methoden und ATP-Tests hinterlassen? Im nächsten Artikel erörtert mein Kollege Cristian Ilea das Potenzial der Impedanz-Durchflusszytometrie und des CytoQuant®-Durchflusszytometers, einer neuen Lösung, die Bakterien und Rückstandspartikel auf Oberflächen sofort quantifiziert.