Die 7 Sünden der GVO-Tests

Der Einsatz von gentechnisch veränderten (GV) Pflanzen nimmt weltweit zu. Dies bietet viele Chancen für die Agrarindustrie, bringt aber auch viele Herausforderungen für die Analyseindustrie mit sich. Ein Experte von Romer Labs teilt sein Wissen über das Testen von gentechnisch veränderten Pflanzen mit Ihnen, damit Sie häufige Fehler in Ihrem Labor vermeiden können.

1. Die Identifizierung des falschen Ziels

Machen Sie Ihre Hausaufgaben: Dies ist vielleicht die grundlegendste Angewohnheit, die jeder Wissenschaftler lernen kann. Dies gilt insbesondere für Tests mit genetisch veränderten Organismen (GVO), bei denen das Erledigen Ihrer Hausaufgaben bedeutet, dass Sie wissen, welche Ereignisse zu Ihren Zielen gehören, damit Sie falsch positive und fehlerhafte Ergebnisse vermeiden können. Das Problem bezieht sich auf Merkmale. Ein Trait ist ein Protein, das aus einer genetischen Veränderung stammt und der Pflanze eine besondere Eigenschaft verleiht. Genetische Veränderungen können in verschiedenen Kombinationen vorkommen, die ähnliche - oder auch völlig unterschiedliche - Eigenschaften hervorbringen. Zu den bekanntesten Elementen genetischer Veränderungen gehören Promotoren (p35S, FMV), Terminatoren (NOSt), kodierende Gene für bestimmte nützliche Eigenschaften (cp4 epsps, pat, bar, Cry1A und andere) und Gene, die selektive Marker kodieren (NPTII, PMI). Ihre Techniker müssen bei der Definition des Ziels für eine GVO-Analyse viele verschiedene Faktoren berücksichtigen. Stellen Sie sicher, dass Sie das Gebiet, aus dem das Produkt stammt, sowie die möglichen Ereignisse berücksichtigen, ob diese Ereignisse in der betreffenden Region zugelassen sind und ob die Pflanze von Interesse über kommerziell verfügbare Biotech-Merkmale verfügt. Das kann knifflig sein: Manchmal gibt es die Veränderung, aber sie ist in bestimmten Regionen nicht zugelassen oder wird nicht angebaut. In einer anderen Region kann sie jedoch weit verbreitet sein. Darüber hinaus hat es Fälle gegeben, in denen nicht zugelassene Ereignisse aus der Eindämmung entkommen sind und ihren Weg auf das Feld gefunden haben.

2. Die Wahl einer fehlerhaften oder unzureichenden Methode

Es kann eine riskante Entscheidung sein: Welchen Umfang sollte ein GVO-Screening haben? Laboratorien können sich auf einige wenige genetische Elemente oder Proteine beschränken, oder sie können den Umfang auf mehrere Ereignisse oder Proteine ausweiten, was teuer sein kann. Es ist wichtig, die Methode zu finden, die Ihren Anforderungen entspricht und genaue Ergebnisse liefert. DNA-basierte Methoden sind zeitaufwändig und hängen von einer hochwertigen DNA-Extraktion und geeigneten Kontrollen ab. Kopienzahlvariationen und Polyploidie können ebenfalls Probleme in den Proben verursachen und sollten bei der Durchführung von DNA-Analysen berücksichtigt werden. Ein Blick auf einige gängige Pflanzen veranschaulicht diesen Punkt. Bei Sojabohnen reicht es nicht aus, nur auf Promotoren und Terminatoren zu testen, da nur wenige der 15 potenziellen Sojabohnen-Events diese gemeinsamen genetischen Elemente enthalten. Bei Mais verhält es sich ganz anders: Ein breites Screening auf diese Elemente ist fast völlig ausreichend, da die meisten Ereignisse in Mais diese Elemente enthalten. Während DNA-basierte Methoden teuer sind und nur in analytischen Servicelabors verwendet werden, ist die Identifizierung von Proteinen relativ billig und nützlich für das Screening nach gemeinsamen Merkmalen vor Ort. Die meisten GV-Ereignisse weisen ein eigenes Maß an veränderter Proteinexpression auf. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Proteinanalyse von Sojabohnen und Raps mit denselben Lateral Flow Device (LFD) Streifen durchführen. Tabelle 1 zeigt die unterschiedlichen Expressionsraten von CP4 EPSPS, die es erforderlich machen, unterschiedliche LFD-Nachweisverfahren für Soja und Raps zu verwenden. Der richtige Ansatz verwendet verschiedene Tests und passt die Empfindlichkeit für verschiedene Rohstoffe an, um ein ähnliches Maß an Nachweis zu erreichen.

3. Unzureichendes Verständnis der unterschiedlichen Empfindlichkeitsgrade der Tests

DNA-basierte Methoden sind sehr empfindlich und können eine einzige Kopie des Zielgens nachweisen. Die Empfindlichkeit von DNA-basierten Methoden wird durch die Anzahl der getesteten Samen begrenzt. Sie beträgt in der Regel 0,01% oder ein gentechnisch verändertes (GV) Saatgut in einem Satz von 10.000 nicht gentechnisch verändertem Saatgut. Diese Empfindlichkeit ist mehr als ausreichend, um mit 99,9 %iger Sicherheit eine bestimmte Nachweisgrenze von bis zu 0,1 % zu erreichen. Andererseits haben proteinbasierte Methoden eine Nachweisgrenze (LOD) von nur 0,1 %, d.h. 1 GV-Saatgut in 1.000 Nicht-GV-Saatgut. Diese Empfindlichkeit reicht jedoch nicht aus, um ein Ergebnis mit 99%iger Sicherheit zu garantieren. Das Beste, was Sie mit einem einzigen Proteintest mit einem LOD von 0,1 % erreichen können, ist ein Wert von 0,46 % bei 99 % Sicherheit. Die ungleichmäßige Verteilung der Samen in realen Proben führt zu dieser Diskrepanz. Um zu 99% sicher zu sein, dass der Grad der GVO-Kontamination unter 0,1% liegt, empfehlen wir Ihnen, mindestens vier Tests mit je 1.000 Kernen bei einer Empfindlichkeit von 0,1% durchzuführen. Für eine 95%ige Sicherheit bei 0,1% führen Sie drei Tests mit 1000 Kernen durch, die alle ein negatives Ergebnis liefern.

4. Entfernung von Verunreinigungen oder Behandlung der Probe

Getreidelabors entfernen oft Verunreinigungen aus den Proben, bevor sie einen Test durchführen. Die Reinigung von GVO-Proben ist jedoch nicht erlaubt. Wenn einige Rückstände, die Spuren von GVO-Pflanzen enthalten, in den Proben verbleiben, sollten diese nachgewiesen werden. Wenn beispielsweise eine Maisprobe einige Rückstände von GVO-Soja (Kerne, Schalen, Staub) enthält, werden diese Rückstände durch Waschen und manuelles Reinigen entfernt und führen zu einem falschen Ergebnis. Unterziehen Sie die Proben keiner Wärmebehandlung, auch nicht, um überschüssige Feuchtigkeit zu trocknen. Insbesondere bei proteinbasierten Methoden könnte dies zu einer Denaturierung der Merkmalsproteine führen und den vollständigen Verlust der Testempfindlichkeit zur Folge haben, da sich das Zielprotein verändert hätte. Die in diesen Anwendungen verwendeten Antikörper wären dann nicht mehr in der Lage, ihre Ziele zu erkennen.

5. Verwendung eines ungeeigneten Verfahrens zur Vorbereitung der Probe

Ihre Methode zur DNA-Isolierung sollte sorgfältig konzipiert und befolgt werden, um einen Abbau der DNA zu vermeiden, der Ihre Ergebnisse verfälschen könnte. Daher ist es wichtig, die Qualität und Quantität der gereinigten DNA zu überprüfen. Neben den verwendeten DNA-Extraktionsreagenzien ist auch die Mahlmethode sehr wichtig. Klingenmühlen liefern die besten Ergebnisse, da sie fein genug mahlen, um die DNA-Extraktion zu ermöglichen. Es ist jedoch unerlässlich, die Mahlgeräte nach der Verwendung gründlich zu reinigen, da Kreuzkontaminationen ein großes Problem bei GVO-Tests darstellen. Nicht ordnungsgemäß gereinigte Geräte können bei nachfolgenden Chargen zu falsch negativen Ergebnissen führen. Die Proteinextraktion erfordert eine gröbere Vermahlung. Es reicht aus, wenn Sie alle Samen in der Probe zerkleinern. Wenn Sie die Samen zu fein mahlen, dauert es zu lange, bis sich der Extrakt absetzt, und die Probe enthält zu viele feste Partikel, die an den LFDs haften und den Flüssigkeitsfluss behindern. Die Mühlen, die für die Extraktion vor der LFD-Analyse verwendet werden, sollten so eingestellt werden, dass keine zu feinen Fraktionen entstehen. Auch die Form des Extraktionsgefäßes sollte berücksichtigt werden: Es sollte nicht flach sein und es ist besser, Einweggefäße zu verwenden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Für die Zerkleinerung von Proteinen werden häufig Mixer verwendet, da sie sehr leicht zu reinigen sind und somit Probleme mit Kreuzkontaminationen vermieden werden können.

6. Anpassung der Testverfahren oder Nichtlesen der Packungsbeilage

Dies könnte die schwerste Sünde sein, die Betreiber begehen. Während Referenzlabore das ganze Jahr über geschultes Personal beschäftigen, haben Getreidelabore oft eine saisonale Beschäftigungspolitik und beschäftigen daher Personal mit weniger Fachkenntnissen im Bereich der Tests. Dies kann dazu führen, dass das Testverfahren im Labor falsch gelesen, falsch befolgt oder verändert wird. Dies kann sich auf alle Teile des Testverfahrens auswirken, angefangen bei der Extraktion bis hin zu Testelementen wie den für den Test erforderlichen Flüssigkeitsmengen, den Entwicklungszeiten und den Analyseverfahren. Stellen Sie sicher, dass Sie alle Verpackungen und Dokumentationen gründlich lesen, bevor Sie eine Analyse durchführen, um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten.

7. Unzureichende Reinigung Ihrer Ausrüstung (verursacht Kreuzkontaminationen)

Stellen Sie sicher, dass die Mühle, die Sie für die GVO-Analyse verwenden, leicht zu reinigen ist. Am besten verwenden Sie abnehmbare Becher und Klingen, damit Sie diese getrennt vom Motor der Mühle reinigen können. Alle Komponenten Ihrer Ausrüstung sollten abwaschbar sein. Blender werden häufig zum Zerkleinern von GVO-Proben verwendet, da sie leicht zu reinigen sind. Mühlen müssen demontiert und alle Teile separat gewaschen werden. Waschen Sie alle Geräte mit Flüssigseife und spülen Sie sie anschließend mit Wasser ab. Verwenden Sie kein Ethanol als Reinigungsmittel; es dient lediglich dazu, den Trocknungsprozess zu beschleunigen. Jedes Labor sollte sein Reinigungsverfahren validieren, um die Effizienz sicherzustellen. Wir empfehlen die Verwendung von Handschuhen bei der Handhabung aller Proben. Das Wechseln der Handschuhe und das Waschen der Hände zwischen den Proben trägt ebenfalls dazu bei, Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass Sie alle Werkzeuge reinigen, die mit dem Extrakt des gemahlenen Materials in Berührung gekommen sein könnten. Eine weitere Lösung besteht darin, so oft wie möglich Einwegartikel zu verwenden.