7 cosas que debe saber sobre los materiales de referencia de micotoxinas

Los materiales de referencia cualificados son un requisito previo para el éxito de la cualificación y la cuantificación en química analítica. Pero, ¿cómo se fabrican? ¿Cómo puede estar seguro de que cumplen las normas de calidad que necesita su laboratorio? ¿Qué son los materiales de referencia certificados? ¿Qué sentido tiene el certificado? Helmut Rost, de Romer Labs, responde a estas preguntas habituales y a otras más.

1. ¿Por qué necesitamos materiales de referencia?

La respuesta corta es que los organismos reguladores y certificadores exigen o recomiendan que los laboratorios los utilicen. Por ejemplo, tanto Estados Unidos como la Unión Europea1 regulan varias micotoxinas estableciendo niveles máximos para esos contaminantes en piensos y alimentos. Además, los laboratorios acreditados según la norma ISO 17025 deben utilizar materiales de referencia cualificados y competentes para mantener su acreditación.

La respuesta un poco más larga es que los laboratorios utilizan materiales de referencia para aumentar la fiabilidad de sus resultados. En las últimas décadas, el análisis de contaminantes como las micotoxinas se ha vuelto cada vez más importante para la caracterización y evaluación de muestras de alimentos y piensos. Los materiales de referencia son sustancias con características definidas, como la aflatoxina B1 disuelta en acetonitrilo a una concentración de 2 µg/mL. Las características específicas de un material de referencia -y, lo que es más importante, su pureza relativa- proporcionan un punto de referencia mediante el cual los técnicos de laboratorio pueden confirmar la exactitud de sus propios resultados.

2. ¿Cómo se define un material de referencia?

Un material de referencia es suficientemente homogéneo y estable con respecto a su propiedad especificada; por ejemplo, tiene un determinado porcentaje de pureza de una micotoxina o micotoxinas como sólido o una determinada concentración como patrón líquido. Estas cualidades garantizan su idoneidad para ser utilizado en el proceso de medición. Los productores de materiales de referencia que cumplen los requisitos de la norma ISO 17034:2016 ("Requisitos generales para la competencia de los productores de materiales de referencia") se consideran competentes. El texto de la norma ISO enumera los requisitos correspondientes a lo largo de varias decenas de páginas junto con bibliografía adicional.

En resumen, el material candidato debe estar bien caracterizado en términos de identidad y pureza antes de que pueda emplearse como iniciador de cualquier material de referencia. Un plan de producción garantiza la correcta documentación de todos los lotes que se produzcan. Las pruebas de estabilidad a largo y corto plazo a diferentes temperaturas deben demostrar que el material es estable hasta su fecha de caducidad especificada. Una prueba de homogeneidad para cada lote confirma que el material está distribuido uniformemente por los recipientes de expedición. Todos los análisis deben cumplir los requisitos de la norma ISO 17025; una acreditación ISO 17034 significa que el laboratorio está acreditado según la norma ISO 17025 con sus métodos analíticos.

3. ¿Cómo se producen los materiales de referencia para el análisis de micotoxinas?

La mayoría de las micotoxinas son producidas por tres géneros de hongos: Aspergillus, Penicillium y Fusarium. Se inocula un material portador con una suspensión fúngica y se incuba durante varias semanas. Se toman muestras durante el proceso de fermentación para confirmar que se está creando la micotoxina objetivo. Los rendimientos típicos del proceso de producción son de varios gramos de micotoxina bruta por kg de material portador y pueden variar significativamente en función de la micotoxina y del proceso de fermentación en cuestión.

Una vez finalizada la incubación, comienza el verdadero trabajo: el ingeniero de laboratorio purifica el extracto bruto muy crudo. Comienza con procesos de filtrado y extracciones líquido-líquido para reducir el peso y el volumen del extracto y eliminar las principales impurezas. El proceso clave de la limpieza consiste en pasos de purificación cromatográfica (semi)preparativa, en los que las impurezas y los subproductos se separan del producto principal debido a su diferente comportamiento de adsorción en la columna cromatográfica. Este trabajo exige un alto grado de destreza y experiencia, ya que cada micotoxina tiene sus propias propiedades y comportamiento de retención. La limpieza concluye con el secado del producto, pesándolo y comprobando de nuevo su calidad.

Un uso específico de los materiales de referencia es como materiales de referencia matriciales (o materiales de control de calidad), que consisten principalmente en una matriz de alimentos o piensos contaminada por micotoxinas de origen natural. Un ejemplo es el maíz con deoxinivalenol. Estos materiales pueden emplearse como control de calidad para apoyar el análisis de muestras específicas de alimentos y piensos.

4. ¿Por qué tiene sentido utilizar materiales de referencia marcados con isótopos para las micotoxinas?

Los analistas que emplean la espectrometría de masas conceden una gran importancia a los materiales de referencia marcados con isótopos, y con razón. Piense en ellos como "supermateriales de referencia" para la espectrometría de masas. Pueden hacer lo mismo que los materiales no marcados con isótopos y mucho más. Por ejemplo, compensan efectos no deseados como la disminución de la eficacia de la extracción, la baja recuperación o el comportamiento de la matriz en el análisis de los analitos; en consecuencia, son esenciales en la puesta a punto de cualquier procedimiento analítico. Los materiales de referencia marcados con isótopos se producen como se ha descrito anteriormente con una diferencia importante: los átomos de 12C se sustituyen por átomos de 13C. Por lo tanto, los productos marcados con isótopos tienen el mismo comportamiento físico y químico que los analitos no marcados. Se añaden antes del análisis y se someten al mismo procedimiento, pero compensan cualquier sobreestimación o subestimación de las micotoxinas no etiquetadas.

5. ¿Cómo se comprueba la calidad de los materiales de referencia?

La pureza, es decir, la calidad del producto, es de suma importancia y debe ser lo más alta posible, o superior al 95%. Mientras que los productos recurrentes pueden compararse con el lote precursor para comprobar su calidad, un producto nuevo debe someterse a una caracterización mucho más exhaustiva. Este tipo de caracterización para materiales sólidos puede implicar varios métodos altamente selectivos y sensibles: la determinación de la estructura mediante espectrometría de masas, espectroscopia infrarroja o espectroscopia de resonancia magnética nuclear puede informarnos sobre cualquier posible impureza inherente.

En cualquier caso, la pureza debe determinarse con la mayor exactitud y precisión posibles. La disponibilidad de un material de referencia certificado puede ser una gran ventaja, ya que permite rastrear directamente el propio material de referencia (véase el número 6). Hoy en día, el método estándar para determinar la cantidad de materiales de referencia líquidos de micotoxinas (materiales sólidos disueltos en un disolvente) es la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) conectada a un detector adecuado como el UV (ultravioleta) o el FLD (detección por fluorescencia). Este método tiene una aplicabilidad casi universal, ya que la mayoría de las micotoxinas son sensibles a la UV/FLD.

En las sustancias marcadas con isótopos, la proporción de 13C respecto a 12C (también conocida como patrón isotópico) puede determinarse mediante una exploración de resolución mejorada con un espectrómetro de masas; la pureza isotópica del 13C debe ser superior al 98%.

Los laboratorios que determinan la propiedad de un material de referencia deben estar acreditados según la norma ISO 17025 ("Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración"). Dado que los laboratorios con certificación ISO 17025 cumplen el requisito de trazabilidad metrológica, sus resultados pueden utilizarse para especificar un material de referencia certificado.

6. ¿Qué es un material de referencia certificado?

Aquí llegamos al nivel más alto de normalización. Un material de referencia certificado se caracteriza por un procedimiento metrológicamente válido para su propiedad (como el % de pureza o concentración) y va acompañado de un certificado que proporciona el valor certificado junto con la incertidumbre calculada de este valor. Lo que esto significa es que existen diferencias entre los materiales de referencia y los materiales de referencia certificados en términos de trazabilidad e incertidumbre. En el trabajo diario de un laboratorio se suelen utilizar materiales de referencia. Si es necesario rastrear un material de referencia, se puede utilizar como referencia el material de referencia certificado con su trazabilidad metrológica. Sin embargo, actualmente sólo existen materiales de referencia certificados para unas pocas micotoxinas.

7. ¿Cómo se lee el certificado?

Un certificado cualificado proporciona la información necesaria sobre el material de referencia. Suele incluir la descripción del producto con el número de lote y la fecha de caducidad, el proveedor con la dirección, la advertencia de peligro, el uso previsto, las instrucciones para un uso correcto, las condiciones de almacenamiento y, lo más importante, el valor de referencia.

La fecha de caducidad se aplica al producto sin abrir en las condiciones de almacenamiento definidas. En el caso de los materiales de referencia certificados, el certificado documenta algunas características más: el valor certificado, el presupuesto de incertidumbre y la discusión de la trazabilidad metrológica. La incertidumbre se calcula basándose en factores como la pureza y la preparación del producto y -si no son despreciables- su estabilidad y homogeneidad (véase el artículo "Ciertas incertidumbres" para más información sobre el cálculo y el uso de los valores de incertidumbre). El valor certificado se confirma mediante un análisis en el que la calibración se realiza frente a un lote de referencia del analito objetivo preparado de forma independiente.

 ¹ EU 2023/915, EU 2024/1022, EU 2024/1038