Tecnologías de pruebas rápidas de higiene ambiental: Una mirada más cercana

Las tecnologías de pruebas medioambientales de uso común se dividen en dos enfoques generales: pruebas de residuos y pruebas de microorganismos. A continuación, investigamos las diferentes tecnologías dentro de cada enfoque, cómo funcionan y su aplicabilidad y ventajas.

Pruebas de residuos

Métodos ATP

El trifosfato de adenosina (ATP) es un nucleótido utilizado en las células como coenzima para suministrar energía. Puede considerarse como la "unidad monetaria" molecular para la transferencia de energía dentro de todas las células vivas. La energía es necesaria para todas las actividades celulares, incluida la síntesis de proteínas y membranas, el movimiento celular y la división celular. La energía se transfiere cuando el ATP se descompone en difosfato de adenosina y monofosfato de adenosina. La hidrólisis de los enlaces covalentes de los fosfatos libera energía que se utiliza para las reacciones.

Los sistemas comerciales de prueba del ATP aprovechan la reacción luciferina/luciferasa, muy común en la naturaleza, para generar luz visible con la energía proporcionada por el ATP. Cuanta más luz se emite, más ATP hay presente, lo que indica que hay más residuos alimentarios o más microorganismos. Sin embargo, hay una advertencia importante: como estos sistemas se utilizan mucho para validar la eficacia de la limpieza, es habitual que en la reacción intervengan también desinfectantes. Estos desinfectantes pueden alterar las paredes celulares de los microorganismos pero preservar su ATP, lo que significa que puede no haber una correlación real entre los organismos vivos presentes en la superficie y los resultados de la medición del ATP.

Los métodos de ATP albergan otra desventaja potencial: su aplicabilidad varía en función del residuo alimentario que se desee detectar. Por ejemplo, las pruebas de ATP no se prestarían para analizar harina de trigo, ya que es una matriz muy procesada que deja poco ATP en sus residuos. Los residuos de productos cárnicos, sin embargo, contienen altos niveles de ATP.

Métodos de detección de proteína total

Como otro enfoque de análisis de residuos, los métodos de detección de proteínas totales no analizan los microorganismos en sí, sino los aminoácidos, péptidos y proteínas. Estas pruebas son muy rápidas y ofrecen resultados en un minuto. La detección no es lo suficientemente sensible como para detectar proteínas de microorganismos unicelulares. Por lo tanto, un resultado negativo con este tipo de prueba no indica la ausencia del microorganismo. Además, no hay forma de detectar patógenos específicos con este método. Aun así, los kits de pruebas de detección de proteínas tienen su utilidad, ya que pueden dar indicaciones sobre la eficacia de la limpieza de forma rápida y asequible.

Pruebas de microorganismos

Métodos de cultivo cromogénicos

Son los métodos tradicionales para controlar la higiene del entorno de procesado. Los métodos de cultivo se abordan en la norma ISO 18593, "Microbiología de la cadena alimentaria - Métodos horizontales para el muestreo de superficies". Pueden utilizarse medios no selectivos y selectivos para detectar organismos específicos.

Métodos basados en agar cromogénico

Por lo general, existen dos formas de llevar a cabo métodos basados en agar: directa o indirectamente mediante un paso de dilución. Una ventaja de ambos es que proporcionan resultados cuantitativos.

En los métodos directos, el agar de las placas o de las láminas de inmersión se presiona directamente sobre la superficie que se está muestreando. Las placas de contacto tienen la forma de las clásicas placas de Petri y suelen tener una superficie de 25 cm². Los dip-slides son paletas de agar de doble cara protegidas por un tubo de plástico y tienen una superficie de agar de 7-10 cm² a cada lado de la paleta, lo que equivale a 14-20 cm². Estos sistemas no requieren equipo adicional y el procedimiento de muestreo es muy rápido. Sin embargo, la superficie de muestreo con este método es limitada.

Los hisopos, los tejidos y las esponjas son herramientas para el muestreo indirecto. Después de pasarlos por la superficie que se va a analizar, se diluyen en una solución tampón, que se pipetea en placas de Petri tradicionales y se vierte. La superficie analizada puede ser mucho mayor y los espacios reducidos y los huecos pueden analizarse con un método indirecto. Sin embargo, los métodos indirectos tienen un inconveniente: hay más pasos de manipulación y se necesitan suministros adicionales. Para la detección de patógenos, la norma ISO recomienda una superficie de entre 1000 cm² y 3000 cm²; una superficie tan grande sólo puede manipularse con esponjas o paños.

Métodos de detección basados en medios líquidos cromogénicos

Este método de cultivo sólo se utiliza para detectar pero no para contar organismos específicos o grupos de organismos, ya que no ofrece resultados cuantitativos. En los métodos basados en medios líquidos, se utilizan hisopos para tomar muestras y luego se introducen en tubos llenos de medios selectivos. Por término medio, la incubación tarda al menos 48 horas para obtener resultados presuntamente negativos. Las muestras positivas se identifican por un cambio de color o florescencia en una longitud de onda específica de la muestra enriquecida. Estas pruebas suelen ser fáciles de utilizar y asequibles.

La desventaja de los sistemas basados en medios líquidos es su bajo grado de sensibilidad, resultado de los medios altamente selectivos, que suprimen intencionadamente el crecimiento de otras bacterias. Aquí existe un cierto riesgo: las bacterias del entorno de procesamiento ya están estresadas y pueden morir si los medios de enriquecimiento son demasiado selectivos. Por otro lado, si la selectividad es demasiado baja, puede resultar difícil detectar microorganismos específicos utilizando únicamente medios líquidos selectivos. La interpretación de los resultados puede llegar a ser difícil y subjetiva, ya que el cambio de color o la fluorescencia no siempre son lo suficientemente fuertes como para indicar un resultado definitivo. La principal ventaja de los métodos basados en medios líquidos es que son fáciles de utilizar y asequibles.

Métodos basados en el ADN

Existen tres métodos diferentes basados en el ADN: la amplificación isotérmica del ADN, la PCR en tiempo real y la PCR tradicional. La PCR en tiempo real es un método establecido para la detección de ADN o ARN, mientras que la amplificación isotérmica es una tecnología más novedosa. El uso de la amplificación isotérmica presenta claras ventajas sobre la PCR en tiempo real: por ejemplo, la amplificación isotérmica no requiere termociclador, ya que la reacción tiene lugar a una temperatura constante. El método basado en el ADN más rentable pero también más laborioso es la PCR tradicional, ya que es necesario realizar un paso de hibridación o utilizar un colorante bastante inespecífico después de la amplificación para detectar el ADN o ARN amplificado. En todos los métodos, partes específicas del ADN o ARN son reconocidas por cebadores específicos y luego multiplicadas por la enzima polimerasa. La sensibilidad de estos métodos es notablemente alta, y las regiones diana en el ADN o ARN son bien conocidas. La mayor limitación de este sistema es que se trata de un sistema basado en enzimas. Las enzimas necesitan soluciones tampón específicas para funcionar correctamente. Los ingredientes de los desinfectantes pueden influir en la actividad enzimática, lo que puede dar lugar a resultados falsos negativos. La tecnología también requiere múltiples pasos de micropipeteo, lo que puede ser una grave fuente de error. La mayor ventaja de los métodos basados en el ADN es que pueden utilizarse medios no selectivos para el paso de enriquecimiento gracias a la alta sensibilidad del método. Los medios no selectivos son asequibles, están disponibles en varios proveedores y requieren el nivel de bioseguridad más bajo (nivel 1). También es posible detectar cantidades bajas de patógenos en superficies ambientales sin enriquecimiento con métodos basados en el ADN, pero la sensibilidad es baja en comparación con la de los métodos basados en el enriquecimiento. Por último, los resultados falsos positivos procedentes de fragmentos de ADN de patógenos que ya han sido eliminados podrían ser un problema importante.

Métodos inmunológicos

Los inmunoensayos son sistemas que utilizan anticuerpos para detectar la presencia de microorganismos en soluciones. Estos anticuerpos pueden unirse a antígenos, como los lipopolisacáridos de la superficie celular o los flagelos de determinados microorganismos. Tras un procedimiento de enriquecimiento único o múltiple que incluye medios selectivos, los patógenos como las células de Listeria se detectan con sistemas de pruebas basados en anticuerpos específicos. Las pruebas ELISA (ensayo inmunoenzimático) fueron las primeras en utilizar la tecnología inmunológica para detectar microorganismos específicos. ELISA permite la cuantificación del analito detectado, pero la necesidad de incluir un paso de enriquecimiento impide cualquier cálculo de la concentración inicial. Sólo personal formado puede realizar los múltiples pasos de transferencia y lavado que requieren los ELISA. El desarrollo de los dispositivos de flujo lateral, también conocidos como pruebas en tira, resolvió este problema, haciendo que el procedimiento de detección inmunológica fuera mucho más fácil y rápido y eliminando la carga de trabajo de las pruebas ELISA. Los dispositivos de flujo lateral con anticuerpos selectivos utilizados en combinación con medios de enriquecimiento de alto rendimiento permiten obtener resultados rápidos y precisos sin necesidad de equipos caros ni costes relacionados con la formación.

Conclusión

Elegir la tecnología de pruebas de higiene adecuada no siempre es una tarea fácil. Hay varias consideraciones prácticas que influirán en la decisión: ¿cuántos lugares de muestreo deben someterse a pruebas y qué importancia tiene el rendimiento de las pruebas? ¿Cómo pueden los encargados de las pruebas optimizar el tiempo hasta la obtención de resultados, dado que las pruebas para algunas bacterias patógenas no se realizan todos los días y son más una tarea de supervisión que un procedimiento de control de calidad? ¿Son necesarios los resultados cuantitativos o basta con las pruebas de presencia/ausencia? Como todavía no es posible obtener recuentos de bacterias inmediatamente después de la limpieza, los productores pueden confiar en los sistemas de pruebas basados en ATP o proteínas, que pueden servir como un indicador vago de si es seguro comenzar la producción, es decir, si hay ATP o proteínas presentes. Además, las normativas nacionales pueden influir en esta decisión. Los métodos inmunológicos o de ADN basados en el enriquecimiento son superiores a otros métodos en términos de sensibilidad y selectividad y deberían ser los sistemas de elección para la detección de patógenos. Para la detección y el recuento de organismos indicadores o el control de la higiene general, pueden utilizarse sistemas más asequibles, como los de inmersión o los de ATP.